ELISA操作的注意事項(xiàng)
ELISA具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測定，為輔助臨床診斷與生物科研起到了積極的推動(dòng)作用。但ELISA測定中影響因素較多，操作過程中每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。

試劑的因素　　

試劑的選擇：試劑的選擇是保證血液檢測質(zhì)量的關(guān)鍵要素。雖然國家采用批批檢定的形式對ELISA試劑嚴(yán)格把關(guān)，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。要選購知名度相對高、具有“三證”的試劑，不要用無批號的試劑，選用與儀器配套的試劑。更不要使用過期的試劑和混用不同批號的試劑。

試劑的準(zhǔn)備：在臨床實(shí)驗(yàn)室，對試劑的準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面時(shí)間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此，在ELISA測定中試劑的準(zhǔn)備*為關(guān)鍵的是，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20-30 min后，再進(jìn)行測定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的目的能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所需的溫度，以滿足后面的測定需求。

樣本的因素

內(nèi)源性干擾因素：包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等。

類風(fēng)濕因子在類風(fēng)濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的類風(fēng)濕因子(RF)，其一般為IgM型，亦有IgG和IgA型，具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn)，因?yàn)樵贓LISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。避免其發(fā)生的方法有：①用F(ab)2替代完整的IgG。②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性IgG的固相吸附劑處理。③檢測抗原時(shí)，可用2-巰基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中使RF降解。

補(bǔ)體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動(dòng)物的固相抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變構(gòu)，使Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合點(diǎn)暴露出來，使C1q成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面，固相抗體也會(huì)因?yàn)榛罨�補(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本。②56℃ 30 min加熱血清使C1q滅活。

外源性干擾因素：包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時(shí)間過長和標(biāo)本凝固不全等。

標(biāo)本的溶血血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物酶(HRP)為標(biāo)志的ELISA測定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。所以在采血時(shí)應(yīng)注意手法，采集的血液勿用力振蕩，嚴(yán)防標(biāo)本溶血。

標(biāo)本的污染菌體可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，可使實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)非特異性顯色。因此，ELISA檢測宜采集新鮮標(biāo)本，如不能當(dāng)時(shí)測定，5 d之內(nèi)應(yīng)4℃保存，1周后檢測應(yīng)低溫凍存；同時(shí)，收集標(biāo)本采用無菌試管，可防止標(biāo)本的污染。

標(biāo)本的保存標(biāo)本在冰箱中保存過久，血清中IgG可聚合成多聚體，AFP可形成二聚體，在用間接法測定中會(huì)導(dǎo)致本底過深，甚至造成假陽性。 冰凍保存的標(biāo)本反復(fù)凍融產(chǎn)生機(jī)械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子有破壞作用，可引起假陰性結(jié)果。因此，ELISA檢測盡量采用新鮮標(biāo)本，長時(shí)凍存的樣本避免反復(fù)融凍。

標(biāo)本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原，可使結(jié)果呈假陽性。解決的方法有：①于采血管中加入適當(dāng)?shù)目鼓齽�；②將采集后的血液放在架子上再放�?7℃水浴中1 h，待充分凝固后再離心分離血清。

操作中的因素　　

加樣：孵育前加樣時(shí)間過長，酶試劑加出孔外，使用滴瓶滴加試劑時(shí)，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準(zhǔn)，都可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。控制方法：①實(shí)驗(yàn)樣本過多時(shí)，可分批次操作，以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長造成的誤差；②加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；③作定量試驗(yàn)時(shí)，使用加樣器加注試劑，并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性，此外，要做到一份樣本一個(gè)移液頭，防止交叉污染。

溫育：溫育是ELISA測定*為關(guān)鍵、*容易出現(xiàn)問題的步驟。*為常見的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2-8℃。目前國內(nèi)售elisa試劑盒溫育時(shí)間為37℃，30 min-1 h，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃，1-2 h能有較完全的結(jié)合。

溫育時(shí)間、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時(shí)間、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時(shí)間，如果是將微孔板一放入溫箱即開始計(jì)時(shí)，這樣就容易造成實(shí)際測定中溫育時(shí)間不夠，易致弱陽性標(biāo)本測不出來。控制方法：①如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長反應(yīng)時(shí)間的條件；②用1個(gè)小溫度計(jì)放置在板孔反應(yīng)液中測量觀察。

“邊緣效應(yīng)”的排除“邊緣效應(yīng)”是在使用96孔板的ELISA測定中，外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的，因此在溫育時(shí)盡量采用水浴。

洗板：ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉，采用半自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，洗液量不足導(dǎo)致洗板不徹底，洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不完全，洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差。控制方法：①手工洗板時(shí)，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；②洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出；③為了洗滌效果好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次，或適當(dāng)增加洗板的次數(shù)，有資料報(bào)道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果。

顯色：市售ELISA試劑盒中，如以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑，要臨用前30 min配制且必須避光。以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光，但A、B液應(yīng)盡量避免接觸金屬器械。

結(jié)果判定：讀取結(jié)果要在15-30 min內(nèi)完成，定性測定用肉眼判讀試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景10-15 cm；定量測定時(shí)用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，酶標(biāo)儀不應(yīng)置于陽光或強(qiáng)光照射下，需先預(yù)熱15-30 min再進(jìn)行測試。

綜上所述，盡管ELISA法操作簡單，但可能影響測定結(jié)果的因素也較多。故在實(shí)際操作的過程中，要加強(qiáng)質(zhì)量管理，認(rèn)真避免或減少影響因素，力求結(jié)果準(zhǔn)確，為疾病的診斷和科研提供可靠的依據(jù)。

原創(chuàng)作者：深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司